神经药理学报

神经药理学报 ›› 2018, Vol. 8 ›› Issue (3): 1-8.DOI: 10.3969/j.issn.2095-1396.2018.03.001

• 实验方法学 •    下一篇

建立体外血脑脊液屏障模型方法学研究

张海威1 ，张丹参2 ，苏晓梅2 ，赵凯燕2， 武春阳1， 张 力1   

  1. 1. 河北北方学院药学系，张家口，075000，中国
    2. 河北科技大学，石家庄，050000，中国
  • 出版日期:2018-06-26 发布日期:2018-11-16
  • 通讯作者: 张力，男，硕士生导师；研究方向：神经药理学；E-mail：hbnulzhang@126.com
  • 作者简介:张海威，男，硕士研究生；研究方向：神经药理学；E-mail：hwzhang1057@163.com 张丹参，女，博士生导师；研究方向：神经药理学；E-mail：zhangds2011@126.com
  • 基金资助:
    国家自然科学基金项目（No.81274005），河北省研究生创新资助项目（No.CXZZSS2017146）

Study on the Establishment of an in vitro Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier Model

ZHANG Hai-wei1， ZHANG Dan-shen2， SU Xiao-mei2， ZHAO Kai-yan2， WU Chun-yang1， ZHANG Li1   

  1. 1. Department of Pharmacy，Hebei North University，Zhangjiakou，075000，China
    2. Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang，050000，China
  • Online:2018-06-26 Published:2018-11-16
  • Contact: 张力，男，硕士生导师；研究方向：神经药理学；E-mail：hbnulzhang@126.com
  • About author:张海威，男，硕士研究生；研究方向：神经药理学；E-mail：hwzhang1057@163.com 张丹参，女，博士生导师；研究方向：神经药理学；E-mail：zhangds2011@126.com
  • Supported by:
    国家自然科学基金项目（No.81274005），河北省研究生创新资助项目（No.CXZZSS2017146）

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摘要：

目的：采用原代分离培养Sprague-Dawley（SD）大鼠脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells，BMECs）和星形胶质细胞（astrocyte，As）建立相对简单可靠、重复性好、接近在体状态的体外血脑脊液屏障（blood-cerebrospinal fluid barrier，blood-CSF barrier）模型。方法：原代分离、纯化和培养BMECs 和As，通过细胞形态学和免疫细胞化学染色方法鉴定原代培养的细胞；通过培养在具有特殊质材和孔径的Transwell 小室上建立体外血脑脊液屏障实验模型，采用倒置显微镜观察细胞形态结构，经跨内皮电阻值（trans endothelialelectrical resistance，TEER）、4 h 液面试漏实验、两种特征性酶检测、荧光素钠通透性（sodium fluorescent，Na-FLU）评价模型的屏障功能。结果：原代培养的BMECs 具有典型的“铺路石”样外观，Ⅷ因子鉴定细胞纯度在95% 以上；As 有细长突触，胞质较浅，胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic portein，GFAP）鉴定细胞纯度在95% 以上。通过测定TEER 值共培养模型组显示高电阻值（378.97±11.38） Ω·cm2；4 h 液面试漏试验阳性；γ- 谷氨酰转肽酶（γ-glutamyltranspeptidase，γ-GT）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）表达分别为（30.88±2.87） μmol·min-1·mL-1 和（2.51±0.88）金氏单位·100 mL-1；Na-FLU 跨膜渗透系数（2.228±0.85）×106 cm·s-1。结论：建立的体外血脑脊液屏障模型在形态学、电阻和通透性方面具备了血脑脊液屏障的基本特性。

关键词: 血脑脊液屏障, 体外模型, 脑微血管内皮细胞, 跨内皮细胞电阻值

Abstract:

Objective：The primary isolated and cultured Sprague-Dawley （SD） rat brain microvascular endothelial cells （BMECs） and astrocyte （As） are established to be an in vitro blood-cerebrospinal fluid barrier（blood-CSF barrier）model that is relatively simple， reliable， reproducible， and nearly in vivo. Methods:BMECs and AS from SD rats were primitively isolated， purified and cultured， and then primitive culture cells were identified by cellular morphological and immunocytochemical staining methods. In vitro blood-CSF barrier model was established by using Transwell culture insert. Model barrier function was evaluated by detection of transendothelial electrical resistance （TEER），4 hours Liquid interview leak test，expression of alkaline phosphatase （ALP） and γ-glutamyl transpeptidase （γ-GT）， permeability of sodium fluorescent（ Na-FLU）. Results:Primary cultured BMECs presented a typical fusiform cobblestone appearance. More than 95% of BMECs were Ⅷ positive. Primary As presented slender synapse and shallower cytoplasm. More than 95% of As were GFAP positive. TEER value for cocultured model group showed （378.97±11.38） Ω·cm2，4-hour liquid leakage test was positive， γ-GT and ALP expressions were （30.88±2.87） μmol·min-1·mL-1 and （2.51±0.88） kingunit· 100 mL-1 respectively，permeability coefficients value of Na-FLU was （2.228±0.85）×106 cm·s-1. Conclusion:The blood-CSF barrier model established in vitro possess in vivo blood-CSF barrier properties in cell morphology，structures and barrier functions.

Key words: blood-cerebrospinal fluid barrier, in vitro model, brain microva-scular endothelial cells, transendothelial electrical resistance

中图分类号: