摘要： 目的：β淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）聚集形成的老年斑是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的重要病理特征之一，由淀粉样前体蛋白（amyloid precusor protein，APP）经成淀粉途径多次水解形成。人APP 基因表达受可变剪接调控，人脑内有三种APP 可变剪接异构体产物。根据这些APP 可变剪接异构体是否表达外显子7，可分为APP-KPI+ 和APP-KPI- 两种类型。据报道，APP-KPI+ 在脑内的表达水平与Aβ的产生呈正相关。GSK3β是脑内和AD 相关的最主要的激酶之一，它的活性在AD 脑内增加，是AD 治疗中的一个潜在的重要靶点。我们的前期研究发现，二苯乙烯苷（stibene glucoside，TSG）能够减少APP 转基因小鼠脑内Aβ含量和淀粉样斑块数量，改善学习记忆功能，但TSG 对APP 可变剪接和GSK3β的影响尚不清楚。方法：构建包含APP 外显子7、8 可变剪接的微型基因（mini-gene）。人胚胎肾细胞（HEK-293FT）、小鼠神经母细胞瘤细胞（Neuro-2a，N2a）内转染APP mini-gene 来模拟APP 外显子7、8 在体内的剪接。在神经细胞N2a 内过表达GSK3β或下调其表达，用RT-PCR 和qPCR 观察GSK3β对APP 可变剪接的影响。在HEK-293FT 细胞内共表达剪接因子ASF 和磷酸激酶GSK3β，用HA 抗体免疫共沉淀ASF，GSK3β抗体检测ASF 与GSK3β之间是否存在相互作用。将ASF、GSK3β单独或者共转染至HeLa 细胞中，用荧光二抗进行染色，观察ASF 和GSK3β的细胞定位。APP/PS1 转基因鼠TSG（50 mg·kg-1·day-1）灌胃处理12 个月，用Western blot 或qPCR 观察鼠脑内相关蛋白在mRNA 和蛋白水平发生的改变。结果：APP mini-gene 在HEK-293FT 和N2a 细胞系内进行表达，RT-PCR 结果可见三个条带，经测序分别是APP770，APP751 和APP695。过表达GSK-3β促进APP 微型基因产物APP-KPI+ 在N2a 细胞内的表达，siGSK3β则抑制APP-KPI+ 表达量；不同浓度LiCl 处理SH-SY5Y 细胞，内源性APP-KPI 表达量随LiCl 浓度增高而降低。SR 蛋白ASF 对APP-KPI+ 的表达影响最大，是最为重要的APP 可变剪接调控因子。GSK3β可以被ASF 免疫共沉淀，存在生理上的相互作用，并且免疫共定位实验显示ASF 与GSK3β有很好的细胞内共定位。TSG 抑制细胞内APP-KPI+ 的表达量，同时发现细胞内AKT-GSK3β信号通路可被TSG 激活。在体内实验中，5 月龄APP/PS1 转基因小鼠灌胃给药TSG12 个月后，脑内AKT 和GSK3β磷酸化水平增加，APPKPI+表达水平降低。结论：成功构建了研究APP-KPI 表达的微型基因。TSG 可以激活神经细胞和APP/PS1 转基因鼠脑内的AKT-GSK3β通路；GSK3β通过与剪接因子ASF 相互作用，从而抑制其促进APP-KPI+ 生成的能力；在体内长期喂食TSG 可降低APP-KPI+ 表达。